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葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)試劑盒說明書（分光光度法）

貨號：LE-1-350

正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體47.5 mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1 支，-20℃保存；

試劑三：粉劑×1 支，-20℃保存；

試劑四：粉劑×1 支，-20℃保存；

產(chǎn)品說明：

葡萄糖-6-磷酸酶（(glucose 6 phosphatase，G6Pase，EC 3.1.3.9）廣泛存在于動物、植物、微生物和細(xì)胞中，是糖異生過程水解葡萄糖-6-磷酸生成葡萄糖的限制酶，在保證血糖的動態(tài)平衡方面起著重要的作用。

G6P 催化葡萄糖-6-磷酸生成葡萄糖，變旋酶和葡萄糖脫氫酶進(jìn)一步依次催化NAD+還原生成NADH，在340nm下測定NADH生成速率，即可反映G6P 活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本的前處理：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為500~1000：1 的比例（建議500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30 次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10 的比例（建議稱取約0.1g 組織，加入1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

二、測定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min 以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

工作液的配制：臨用前將試劑二、試劑三和試劑四轉(zhuǎn)移到試劑一中混合待用；用不完的試劑4℃保存一周；

2、將工作液置于37℃(哺乳動物)或25℃（其它物種）預(yù)熱5分鐘。

3、 在1mL 石英比色皿中加入50μL 樣本和950μL 工作液，立即混勻，記錄340nm 處初始吸光值A(chǔ)1 和 2min 后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

注意：

在該試劑盒中，若ΔA 大于0.3，需將樣本用提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后測定，使ΔA 小于0.3 可提高檢測靈敏度。計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

G6P 活性計(jì)算：

1、血清（漿）G6P 活力計(jì)算

單位定義：每毫升血清（漿）每分鐘生成1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

G6P（U/mL）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T

=1608×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中G6P 活力計(jì)算

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成1nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

G6P（U/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=1608×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g 組織每分鐘生成1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

G6P（U/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T

=1608×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位定義：每1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

G6P（U/10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=3.215×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-3 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.05 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。