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乙酸激酶（acetate kinase，ACK）試劑盒說明書（分光光度法）

貨號(hào)：LE-1-383

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

ACK 主要存在于微生物中，催化乙酸和 ATP生成乙酰磷酸和 ADP，是細(xì)菌碳代謝和能量代謝的關(guān)鍵酶，尤其是在古細(xì)菌甲烷合成代謝中起著中樞作用。

測(cè)定原理：

（1）ACK 催化乙酸鈉和 ATP 生成乙酰磷酸和 ADP

（2）丙酮酸激酶催化 ADP 和 PEP 生 成 ATP 和丙酮酸

（3）乳酸脫氫酶催化丙酮酸和 NADH 生成乳酸和 NAD⁺ 

（4）在 340nm 下測(cè)定 NADH 氧化生成  NAD⁺ 速率，即可反映 ACK 活性

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL  石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水

試劑組成和配制：

提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×2 瓶，-20℃保存；

試劑三：液體 1.2mL×1 支，4℃保存；

樣本的前處理：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量 （10⁴ 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000 ：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提 取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 15000g 4℃離心 10min ，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。15000g 4℃離心 10min ，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定

（1）工作液的配置：臨用前取試劑二一瓶，加入 25mL 試劑一和 500μL 試劑三，充分混合 溶解，置于 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 5min；現(xiàn)配現(xiàn)用；

（2）在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 樣本和 900μL 工作液，混勻，立即記錄 340nm 處 20s 時(shí)的吸光值 A1 和 3min20s 后的吸光值 A2 ，計(jì)算 ΔA=A1-A2。

ACK 活性計(jì)算：

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 

ACK（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=536×ΔA÷Cpr

2、按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

ACK（nmol/min /g  鮮重）= [ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(W×V 樣÷V 樣總) ÷T

=536×ΔA÷W

3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

ACK（nmol/min /10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T

=1.072×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-3 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d： 比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.1 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T： 反應(yīng)時(shí)間，3 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總 數(shù)，500 萬。