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土壤亞硝酸還原酶（S-NiR） 試劑盒說明書（可見分光光度法）

產(chǎn)品內(nèi)容：

試劑一：液體30mL×1  瓶，-20℃保存。

試劑二：粉劑5mL×1  瓶，-20℃保存（臨用前加入5ml蒸餾水） 。

試劑三：液體5mL×1  瓶，4℃保存。

試劑四：粉劑10mL×1  瓶，-20℃保存（臨用前加入10ml蒸餾水） 

試劑五：液體25mL×1  瓶，4℃保存（如出現(xiàn)結(jié)晶析出，60 度水浴溶解后使用） 。

試劑六：液體25mL×1  瓶，4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體1mL×1支，10μmol/mL  亞硝酸鈉； -20℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)液的配制：用時蒸餾水將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋0.8 、0.6 、0.4 、0.2 、0. 1μmol/mL。

產(chǎn)品說明：

S-NR 催化土壤中硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，是土壤硝態(tài)氮還原的關(guān)鍵酶。研究S-NR 的活性 對合理施肥，降低氮素的損失具有重要意義。S-NR 催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，NO3ˉ +NADH+H＋→ NO2ˉ +NAD＋+H2O；產(chǎn)生的亞硝酸鹽能夠在酸性條件下，與對–氨基苯磺酸及α-萘胺定量生成紅色偶氮化合物；未反應(yīng)的NADH會抑制后續(xù)的顯色反應(yīng)，用PMS將其中和后再進行后續(xù)反應(yīng)；生成的紅色偶氮化合物在 520 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法測定。

自備實驗用品及儀器：

可見分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量比色皿/96孔板、冰和蒸餾水。

操作步驟：

1 、分光光度計預(yù)熱30min 以上，調(diào)節(jié)波長至520nm ，蒸餾水調(diào)零。

2 、樣本測定

混勻，顯色20min后， 520nm下讀取各管吸光值。計算 ΔA測定=A測定- A對照。 ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白。

活性計算：

1 、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：

以 0.8 、0.6 、0.4 、0.2 、0. 1μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液為橫坐標(biāo)， ΔA 標(biāo)準(zhǔn)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到 線性回歸方程 y=kx+b ，將 ΔA 測定代入方程得到 x（ μmol/mL）；

2 、S-NR 活性計算

單位的定義： 24h 每 g 土樣中產(chǎn)生 1μmol NO2ˉ的量為一個 S-NR 活力單位。

S-NR（U/g）=x×V 標(biāo)準(zhǔn)÷W÷T=24×x

V 標(biāo)準(zhǔn)： 反應(yīng)體系中加入的標(biāo)準(zhǔn)液體積，0. 1mL；W：樣本鮮重，0. 1g；T：反應(yīng)時間，1/24h。

注意事項：

1 、試劑一、試劑二和試劑四在冰上放置，用完立即放回-20℃。

2 、每個測定管設(shè)一個對照管。

3 、ΔA 測定過?。ㄐ∮?nbsp;0.01），可延長反應(yīng)時間（37℃水浴時間）。