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土壤中性磷酸酶（S-NP）活性檢測(cè)試劑盒說明書（可見分光光度法）

產(chǎn)品內(nèi)容：

試劑一：液體 21mL×1 瓶，4℃避光保存。

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。用前加 50mL 蒸餾水充分溶解。

試劑三：液體 11mL×1 瓶，4℃保存。

試劑四：粉劑×1 支，4℃避光保存。臨用前加 1152μL 無水乙醇（自備），48 μL 蒸餾水充分溶解。（變褐色后不能再使用）

標(biāo)準(zhǔn)品：液體 1mL×1 支，0.5 μmol/mL 苯酚標(biāo)準(zhǔn)液，4℃保存。

產(chǎn)品說明：

土壤磷酸酶是一類催化土壤有機(jī)磷礦化的酶，其活性的高低直接影響著土壤中有機(jī)磷的分解轉(zhuǎn)化及其生物有效性，是評(píng)價(jià)土壤磷素生物轉(zhuǎn)化方向與強(qiáng)度的指標(biāo)。土壤磷酸酶受到土壤碳、氮含量、有效磷含量和 pH 顯著影響，根據(jù)最適 pH 范圍，通常分為酸性、中性和堿性三種類型。中性環(huán)境中， S-NP 催化磷酸苯二鈉水解生成苯酚和磷酸氫二鈉，通過測(cè)定酚的生成量即可計(jì)算出 S-NP 活性。

試驗(yàn)中所需的儀器和試劑：

可見分光光度計(jì)、1mL 玻璃比色皿、臺(tái)式離心機(jī)、37℃恒溫培養(yǎng)箱、分析天平、可調(diào)式移液器、冰、蒸餾水、乙醇和甲苯。

操作步驟：

一、粗酶液提?。?/span>

稱取風(fēng)干混勻土壤約 0.1g，加入 0.05mL 甲苯（自備），輕搖 15min；加 0.4 mL 試劑一并且搖勻后，置于 37℃恒溫培養(yǎng)箱，開始計(jì)時(shí)，催化反應(yīng) 24h；到時(shí)后迅速加入 1mL 試劑二充分混勻，以終止酶催化的反應(yīng)。8000rpm，25℃離心 10min，取上清液置于冰上待測(cè)。

二、測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 660 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、空白管：取 1mL 玻璃比色皿，加入 50 μL 試劑一，200 μL 試劑三，20 μL 試劑四，充分混勻， 顯色后再加蒸餾水 730 μL，混勻后室溫靜置 30 min，于 660 nm 測(cè)定吸光度，記為 A 空白管。

3、標(biāo)準(zhǔn)管：取 1mL 玻璃比色皿，加入 50 μL 標(biāo)準(zhǔn)液，200 μL 試劑三，20 μL 試劑四，充分混勻， 顯色后再加蒸餾水 730 μL，混勻后室溫靜置 30 min，于 660 nm 測(cè)定吸光度，記為 A 標(biāo)準(zhǔn)管。

4、測(cè)定管：取 1mL 玻璃比色皿，加入 50 μL 上清液，200 μL 試劑三，20 μL 試劑四，充分混勻， 顯色后再加蒸餾水 730 μL，混勻后室溫靜置 30 min，于 660 nm 測(cè)定吸光度，記為 A 測(cè)定管。

注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)定一次。

三、S-NP 活性計(jì)算：

活性單位定義：37℃中每克土壤每天釋放 1nmol 酚為 1 個(gè)酶活單位。

S-NP（nmol/d/g）=[C 標(biāo)準(zhǔn)液×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)] ×1000×V 總÷W÷T

=725×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)÷W

C 標(biāo)準(zhǔn)液：0.5 μmol/mL； V 總：催化體系總體積，1.45mL；W：土壤樣品質(zhì)量，g；T：催化反應(yīng)時(shí)間，24 h=1 d；1000：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1μmol=1000nmol。

注：線性范圍為 0.03125μmol/mL-1.5μmol/mL。