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蔗糖磷酸化酶試劑盒說明書（分光光度法）

貨號：LE-1-288

測定意義

SP(EC2.4.1.7)主要存在于微生物和植物中，裂解葡萄糖苷鍵，催化葡萄糖基轉(zhuǎn)移到果糖、木糖、半乳糖和鼠李糖等，合成相應(yīng)的葡萄糖基低聚糖。此外，SP還能催化氫醌合成熊果苷，

具有極強(qiáng)的美白效果，在化妝品工業(yè)中具有重要應(yīng)用。

測定原理

SP 能夠以磷酸為受體，催化蔗糖產(chǎn)生1-磷酸葡萄糖，在葡萄糖磷酸變位酶催化下變位為 6-磷酸葡萄糖，在6-磷酸葡萄糖脫氫酶作用下還原 NADP +生成 NADPH，導(dǎo)致340nm光吸收值增加。測定340nm吸光度增加速率，即可計(jì)算SP活性。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器

天平、低溫離心機(jī)、恒溫水浴鍋、紫外分光光度計(jì)、1 mL 石英比色皿和蒸餾水。

試劑組成和配制

提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

緩沖液：液體 40mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 25mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 2mL×1 支，4℃保存。

試劑三：液體 1mL×1 支，4℃保存。

試劑四：粉劑 1 瓶，-20℃避光保存，臨用前加 5mL 雙蒸水溶解。

試劑五：粉劑 1 瓶，-20℃避光保存，臨用前加 5mL 雙蒸水溶解。

試劑六：粉劑 1 瓶，-20℃避光保存，臨用前加 10mL 雙蒸水溶解。

試劑七：粉劑 1 瓶，-20℃避光保存，臨用前加 10mL 雙蒸水溶解。

粗酶液提取

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后 10000g，4℃，離心 10min，取上清待測。

2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7秒，總時間 3min）；然后 10000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測。

測定操作表

SP  活性計(jì)算公式

1. 按照蛋白濃度計(jì)算

酶活定義：37℃，pH6.8 時，每毫克蛋白質(zhì)每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 為一個酶活單位。

SP 活性（nmol/min/mg prot）=△A÷（e×d）×V 反總÷V 樣÷Cpr÷T=804×△A÷Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活定義：37℃，pH6.8 時，每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 為一個酶活單位。

SP 活性（nmol/min/g）=△A÷（e×d）×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)÷T=804×△A÷W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活定義：37℃，pH6.8 時，每10⁴個細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 為一個酶活單位。

SP 活性（nmol/min/10⁴ cell）=△A÷（e×d）×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量（萬個）)÷T=804×△A÷細(xì)胞數(shù)量（萬個）

e：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6220 L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積，2mL；V 樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.2mL；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL；T：反應(yīng)時間，2min

注意事項(xiàng)

1. 粉劑-20℃保存，配制好的試劑 3 天內(nèi)使用完。

2. 可選用 BCA 法測定蛋白含量試劑盒測定蛋白含量。