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丙酮酸脫羧酶活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)(分光光度法)

貨號(hào)：LE-1-143

正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

PDC 主要存在于酵母中，是乙醇發(fā)酵的關(guān)鍵酶之一，催化丙酮酸脫羧生成乙醛。

測(cè)定原理：

PDC 催化丙酮酸脫羧生成乙醛，添加乙醇脫氫酶（ADH）來(lái)進(jìn)一步催化 NADH 還原乙醛生 成乙醇和 NAD+；NADH 在 340 nm 有吸收峰，而 NAD+沒(méi)有；通過(guò)測(cè)定 340 nm 光吸收下降 速率，來(lái)計(jì)算 PDC 活性。

自備儀器和用品：

研缽、冰、臺(tái)式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、1mL 石英比色皿、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 36mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。

試劑四：粉劑×1 支，﹣20℃保存。

試劑五：液體 60μL×1支，﹣20℃保存。

混合試劑：臨用前配制，將試劑四和試劑五轉(zhuǎn)移至試劑三中充分溶解待用，用不完的試劑分 裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑六：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1、細(xì)菌或細(xì)胞處理：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 試劑一，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率 200W，工作 3s，間歇 10s，工作 35 次）， 16000g 4℃離心 20min ，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織處理：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組 織，加入 1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿，16000g 4℃離心 20min，取上清，置冰上待測(cè)。

3、血清（漿）等液體樣品：直接檢測(cè)。

PDC 測(cè)定操作：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑二置于 25℃水浴中預(yù)熱 30 min。

3、依次在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 上清液、100μL 混合試劑、700μL 試劑二和 100μL 試劑六，迅速混勻后于 340nm 比色，記錄 15s 和 75s 的吸光值，分別記為 A1 和 A2 。計(jì)算 ΔA=A1-A2。

PDC 活性計(jì)算公式：

1、按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：25℃中，每毫克蛋白每分鐘催化 1nmol NADH 氧化為 1 個(gè)酶活單位。 

PDC (nmol/min/mg prot) =  ( ΔA÷ε÷d×V 總×10⁹ ）÷(Cpr×V 樣) ÷T

=1608×ΔA÷Cpr

2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中，每克組織每分鐘催化 1nmol NADH 氧化為 1 個(gè)酶活單位。 

PDC (nmol/min /g 鮮重) =  ( ΔA÷ε÷d×V 總×10⁹ ）÷(W×V 樣÷V 樣總) ÷T

=1608×ΔA÷W

3、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中，每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化 1nmol NADH 氧化為 1 個(gè)酶活單位。

PDC (nmol/min/10⁴ cell) =  ( ΔA÷ε÷d×V 總×10⁹ ）÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總) ÷T

=1608×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量

4、按血清（漿）體積計(jì)算

活性單位定義：25℃中，每毫升血清（漿）每分鐘催化 1nmol NADH 氧化為 1 個(gè)酶活單位。

PDC (nmol/min /mL) =  ( ΔA÷ε÷d×V 總×10⁹ ）÷V 樣÷T

=1608×ΔA

ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 總：反應(yīng)體系總體積，1mL=0.001 L ，V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，0.1mL；Cpr：蛋白濃度（mg/mL）， 需要另外測(cè)定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量試劑盒；W：樣本質(zhì)量，g  ；V 樣總：加 入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min。