伊人久久大香线焦|久久青青草国产第一页|亚洲国产九九九热视频|超乳视频爆乳无码免费专区|欧美日韩亚洲视频一区二区|少妇高潮惨叫喷水在线观看|亚洲区欧美区偷拍区中文字幕|国产日韩一区二区三区在线观看

中性蛋白酶（Neutral protease, NP） 活性測定試劑盒說明書(分光光度法)

貨號：LE-1-360

正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

NP 在一定的溫度和中性 pH 條件下，催化水解蛋白質(zhì)。由于其安全無毒、水解能力強、作用范圍廣等特點，中性蛋白酶常用于食品、飼料、化妝品和營養(yǎng)保健品生產(chǎn)。

測定原理：

中性條件下，NP 催化酪蛋白水解產(chǎn)生酪氨酸；在堿性條件下，酪氨酸還原磷鉬酸化合物生成鎢藍；在 680nm 有特征吸收峰。

自備儀器和用品：

可見分光光度計、水浴鍋、磁力攪拌器、可調(diào)式移液槍、1mL 玻璃比色皿、1.5 mL EP 管和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體 90mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加 10 mL 蒸餾水溶解。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃避光保存。臨用前加入 20 mL 試劑一，沸水浴中磁力攪拌溶解。（可在燒杯上蓋一層保鮮膜，注意觀察，避免水分全部蒸發(fā)，一般加熱 15-30 分鐘，該試劑為過 飽和試劑，充分混勻后仍出現(xiàn)顆粒物不溶物不影響使用）。

試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加50 mL 蒸餾水溶解。

試劑五：液體 10mL×1 瓶，4℃保存。

標準品：液體 1mL×1 支，0.25 μ mol/mL 標準酪氨酸溶液，4℃保存。

粗酶液提?。?/span>

1、組織： 按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1： 5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）冰浴勻漿，8000g，4℃離心 10min，取上清， 即粗酶液。

2、血清或培養(yǎng)液：直接測定。

3、細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（10⁴ 個）： 試劑一體積（mL）為 500~1000： 1 的比例（建議 500 萬細胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；然后 8000g，4℃,離心 10min， 取上清置于冰上待測。

測定操作：

1、分光光度計預熱 30min，調(diào)節(jié)波長到 680 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑二、試劑三和試劑四置于 30℃水浴保溫 30min。

3、對照管：取一支 EP 管，加入 100μL 粗酶液，200μL 試劑二，混勻后置于 30℃水浴保溫 10min；加入 200μL 試劑三，混勻后 8000g，  4℃離心 10min；取 200μL 上清液，加入新的 EP 管，再加入 1000μL 試劑四，200μL 試劑五，混勻后置于 30℃水浴保溫 20min，于 680nm 測定光吸收，記為 A 對照管。

4、測定管：取一支 EP 管，加入 100μL 粗酶液，200μL 試劑三，混勻后置于 30℃水浴保溫 10min；加入 200μL 試劑二，混勻后 8000g，  4℃離心 10min；取 200μL 上清液，加入新的 EP 管，再加入 1000μL 試劑四，200μL 試劑五，混勻后置于 30℃水浴保溫 20min，于 680nm 測定光吸收，記為 A 測定管。（注意與空白管不同，先加試劑三，后加試劑二）

5、空白管：取 EP 管，加入 200μL 蒸餾水，1000μL 試劑四，200μL 試劑五，混勻后置于 30℃ 水浴保溫 20min，于 680nm 測定光吸收，記為 A 空白管。

6、標準管：取 EP 管，加入 200μL 標準品，1000μL 試劑四，200μL 試劑五，混勻后置于 30℃水浴保溫 20min，于 680nm 測定光吸收，記為 A 標準管。

注意：空白管和標準管只需要測定一次。

計算公式：

1、按照樣本蛋白濃度計算

NP 活性單位定義：30℃每毫克蛋白每分鐘水解產(chǎn)生 1nmol 酪氨酸為 1 個酶活單位。

NP 活性（nmol/min /mg prot）= C 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管） ×V 反總÷(Cpr×V1)÷T

= 125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）÷Cpr

2、按照樣本質(zhì)量計算

NP 活性單位定義：30℃每克樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生 1 nmol 酪氨酸為 1 個酶活單位。

NP 活性（nmol/min /g 鮮重）=C 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管） ×V 反總÷（W×V1÷V2）÷T

= 125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）÷W

3、按照液體體積計算

NP 活性單位定義：30℃每毫升樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生 1nmol 酪氨酸為 1 個酶活單位。

NP 活性（nmol/min/mL）=C 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）×V 反總÷V1÷T

= 125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）

4、按照細胞數(shù)量計算

NP 活性單位定義：30℃每 10⁴ 個細胞每分鐘催化水解產(chǎn)生 1nmol 酪氨酸為 1 個酶活單位。

NP 活性（nmol/min /10⁴ cell）=C 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管） ×V 反總÷（細胞數(shù)量×V1÷V2）÷T

= 125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）÷細胞數(shù)量

C 標準品：0.25 μ mol/mL 標準酪氨酸溶液；V 反總： 酶促反應總體積，0.5mL；Cpr：粗酶 液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）；V1：加入反應體系中粗酶液體積（mL），0.1 mL；V2 ：提取液總 體積（mL）， 1mL； T：催化反應時間（min）， 10min；W：樣品質(zhì)量（g）。

注意事項：

臨用前配制的試劑配制好后 4℃保存，并且 3 天內(nèi)使用完畢。