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堿性蛋白酶（AKP）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)（分光光度法）

貨號(hào)：LE-1-361

正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

AKP 是指在堿性條件下催化蛋白質(zhì)肽鍵水解的酶類(lèi)，屬于絲氨酸蛋白酶。此外，該酶還能夠水解酯鍵、酰胺鍵，具有轉(zhuǎn)酯及轉(zhuǎn)肽的功能。該酶是主要工業(yè)用酶之一，廣泛應(yīng)用于制藥、絲綢、食品、制革等行業(yè)。

測(cè)定原理：

在堿性條件下，AKP 水解酪蛋白生成酪氨酸；在堿性條件下 ，酪氨酸還原磷鉬酸生成鎢藍(lán)；鎢藍(lán)在 680nm 有特征吸收峰，測(cè)定 680nm 吸光度增加速率，來(lái)計(jì)算 AKP 活性。

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、水浴鍋、磁力攪拌器、可調(diào)式移液槍、1.5 mL EP管、1mL 玻璃比色皿和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體 90mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加 10 mL 蒸餾水溶解。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃避光保存。臨用前加入 20 mL 試劑一，沸水浴中磁力攪拌溶解。（可 在燒杯上蓋一層保鮮膜，注意觀察，避免水分全部蒸發(fā)，一般加熱 15-30 分鐘，該試劑為過(guò) 飽和試劑，充分混勻后仍出現(xiàn)顆粒物不溶物不影響使用）。

試劑四：粉劑×1瓶， 4℃保存。臨用前加50 mL 蒸餾水溶解。

試劑五：液體 10mL×1 瓶，4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體 1mL×1 支，0.25 μ mol/mL 標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液，4℃保存。

粗酶液提?。?/span>

1、組織： 按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1： 5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織， 加入 1mL 試劑一）冰浴勻漿，8000g，4℃離心 10min，取上清， 即粗酶液。

2、血清或培養(yǎng)液：直接測(cè)定。

3、細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）： 試劑一體積（mL）為 500~1000： 1  的比例（建 議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 8000g，4℃,離心 10min， 取上清置于冰上待測(cè)。

測(cè)定操作：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 680 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑二、試劑三和試劑四置于 40℃水浴保溫 30min。

3、對(duì)照管：取一支 EP 管，加入 100μL 粗酶液（血清或培養(yǎng)液），200μL 試劑二，混勻后置 于 40℃水浴保溫 10min；加入 200μL 試劑三，混勻后 8000g ，4℃離心 10min；取 200μL 上 清液，加入新的 EP 管，再加入 1000μL 試劑四，200μL 試劑五，混勻后置于 40℃水浴保溫 20min，于 680nm 測(cè)定光吸收，記為 A 對(duì)照管。

4、測(cè)定管：取一支 EP 管，加入 100μL 粗酶液（血清或培養(yǎng)液），200μL 試劑三，混勻后置 于 40℃水浴保溫 10min；加入 200μL 試劑二，混勻后 8000g ，4℃離心 10min；取 200μL 上 清液，加入新的 EP 管，再加入 1000μL 試劑四，200μL 試劑五，混勻后置于 40℃水浴保溫 20min，于 680nm 測(cè)定光吸收，記為 A 測(cè)定管 。（注意與對(duì)照管不同，先加試劑三，后加試劑二）

5、空白管：取一支 EP 管，加入 200μL 蒸餾水 ， 1000μL 試劑四200μL 試劑五，混勻后置于40℃水浴保溫 20min，于 680nm 測(cè)定光吸收，記為 A 空白管。

6、標(biāo)準(zhǔn)管：取 EP 管，加入 200μL 標(biāo)準(zhǔn)品，1000μL 試劑四，200μL 試劑五，混勻后置于40℃ 水浴保溫 20min，于 680nm 測(cè)定光吸收，記為 A 標(biāo)準(zhǔn)管。

注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要測(cè)定一次。

計(jì)算公式：

1、按照樣本蛋白濃度計(jì)算

AKP 活性單位定義：30℃每毫克蛋白每分鐘水解產(chǎn)生 1nmol 酪氨酸為 1 個(gè)酶活單位。

AKP 活性（nmol/min /mg prot）= C 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管）×V 反總÷(Cpr×V1)÷T

= 125×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管）÷Cpr

2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算

AKP 活性單位定義：30℃每克樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生 1 nmol 酪氨酸為 1 個(gè)酶活單位。

AKP 活性（nmol/min /g 鮮重）=C 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管）×V 反總÷（W×V1÷V2）÷T

= 125×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管）÷W

3、按照液體體積計(jì)算

AKP 活性單位定義：30℃每毫升樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生 1nmol 酪氨酸為 1 個(gè)酶活單位。

AKP 活性（nmol/min/mL）=C 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管）×V 反總÷V1÷T

= 125×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管）

4、按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

AKP 活性單位定義：30℃每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化水解產(chǎn)生 1nmol 酪氨酸為 1 個(gè)酶活單位。 

AKP 活性（nmol/min /10⁴  cell）=C 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白  管）×V 反總÷（細(xì)胞數(shù)量×V1÷V2）÷T

= 125×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空  白管）÷細(xì)胞數(shù)量

C 標(biāo)準(zhǔn)品：0.25 μ mol/mL 標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液；V 反總： 酶促反應(yīng)總體積，0.5mL；Cpr：粗酶 液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）；V1：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積（mL），0.1 mL；V2 ：提取液總 體積（mL）， 1mL； T：催化反應(yīng)時(shí)間（min）， 10min；W：樣品質(zhì)量（g）。

注意事項(xiàng)：

臨用前配制的試劑配置好后 3 天內(nèi)使用完畢