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胰蛋白酶（Trypsin）試劑盒說明書(分光光度法)

貨號：LE-1-357

正式測定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

胰蛋白酶選擇性水解變性蛋白質(zhì)中由賴氨酸或精氨酸的羧基所構(gòu)成的肽鏈，是一種重要的消化酶。此外， 胰蛋白酶還廣泛應(yīng)用于膿胸、血胸、外科炎癥、潰瘍、創(chuàng)傷性損傷等所產(chǎn)生的局部水腫、血腫及膿腫等的輔助治療。

測定原理：

胰蛋白酶催化水解 TAME  的酯鍵，釋放出的游離羧基與反應(yīng)體系中的氫氧化鈉發(fā)生中和反應(yīng)，導(dǎo)致溶液的 pH 值降低，以苯酚紅為指示劑，測定溶液在555nm 處吸收值的變化，可以 快速測得胰蛋白酶活性數(shù)據(jù)。胰蛋白酶在一定范圍內(nèi)與 555nm 處吸收值的降低呈良好的線 性關(guān)系。

自備儀器和用品：

紫外可見分光光度計(jì)、1mL 玻璃比色皿、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體 60 mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 10 mL×1 瓶，4℃避光保存。

試劑二：液體 10mL×1 瓶，4℃避光保存。

試劑三：液體 4 mL×1 瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1、組織樣品：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組 織，加入 1mL 提取液）冰浴勻漿，10000g ，4℃離心 10min，取上清，即粗酶液。

測定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長到 555 nm ，蒸餾水調(diào)零。

2、工作液的配制：臨用前根據(jù)用量按照試劑一（V）：試劑二（V）：蒸餾水（V）：試劑三（V） = 1 mL：1 mL ：5.4 mL：0.4 mL 的比例充分混合。（注意：現(xiàn)用現(xiàn)配，用多少配多少，在空  瓶中配制，試劑盒中帶有 4 個(gè)空瓶）

3、吸取25μL樣本，加入 975 μL工作液，混勻后立即測定，記錄 555nm 下 1min 時(shí)的吸光值 A1和2min時(shí)的吸光值A(chǔ)2。計(jì)算△A=A1-A2

注意：如果△A小于0.005，可將反應(yīng)時(shí)間延長到5min。如果△A大于0.5，體系迅速變色， 可將樣本用提取液稀釋后測定（建議稀釋10倍），計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

胰蛋白酶活性計(jì)算公式：

使用石英比色皿測定的計(jì)算公式如下 

1、按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：室溫下每毫克蛋白質(zhì)每分鐘催化 555nm 處吸光值減少 1 為 1 個(gè)酶活單位。

胰蛋白酶（U/mg prot）=  △A ×V 反總 ÷（Cpr×V1）÷T 

=40×△A÷Cpr

2、按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：室溫每克組織每分鐘催化 555nm 處吸光值減少 1 為 1 個(gè)酶活單位。

胰蛋白酶（U/g  鮮重）= △A×V 反總÷（W×V1÷V2）÷T 

=40×△A ÷W

Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測定；W：組織質(zhì)量（g）；V1：加入反應(yīng)體 系中粗酶液體積（mL），25 μL=0.025mL；V2：粗酶液總體積（mL），1 mL；V 反總：反應(yīng) 總體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min），1 min。