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磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC)試劑盒說明書（分光光度法）

貨號：LE-1-233

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

PEPC（EC  4.1.1.31 ）廣泛存在于動物、植物、微生物和細胞中，是催化磷酸烯醇式丙酮酸與二氧化碳反應(yīng)生成草酰乙酸呈不可逆反應(yīng)的酶，對三羧酸循環(huán)的運轉(zhuǎn)起重要調(diào)節(jié)作用。

測定原理：

PEPC 催化磷酸烯醇式丙酮酸和 CO₂ 生成草酰乙酸和 HPO4^2-，蘋果酸脫氫酶進一步催化草 酰乙酸和 NADH 生成蘋果酸和 NAD⁺，在 340nm 測定 NADH 減少速率，計算 PEPC 活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、臺式離心機、可調(diào)式移液器、 1 mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 30 mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體 10 mL×1 瓶，4℃保存；

試劑三：粉劑×2 支，-20℃保存， 臨用前加入 4mL 蒸餾水充分溶解待用；現(xiàn)配現(xiàn)用。

試劑四：粉劑×1支， -20℃保存 ，臨用前加入 5mL 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝 后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑五：原液 20μL×1 支，4℃保存；

試劑五：稀釋液 10mL×1 瓶，4℃保存；

樣本的前處理：

1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~1000： 1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提  取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織： 按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液）， 進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑五工作液的配制：將試劑五原液：試劑五稀釋液=1μL:329μL 稀釋，用多少配多少。

3、將試劑一、二、三、四和試劑五工作液置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)預(yù)熱 5 分鐘。

4、加樣表：

將上述試劑按順序加入 1 mL 石英比色皿中，立即混勻，加樣本的同時開始計時，340 nm 波 長下記錄初始吸光度 A1 和反應(yīng) 5 分鐘后的吸光度 A2。計算 ΔA=A1-A2。

注意事項：

如果一次性測定樣本數(shù)較多，可將試劑一、二、三、四、和試劑五工作液按比例配成混合液。

PEPC 活性計算：

1、血清（漿）PEPC 活力計算

單位定義 ：每毫升血清（漿）每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。 

PEPC（nmol/min/mL））＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T

=1624×ΔA

2、組織、細菌或細胞中PEPC 活力計算

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

PEPC（nmol/min/mg prot） ＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=1624×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

PEPC（nmol/min/g  鮮重）＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T

=1624×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位定義：每 1 萬個細胞每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

PEPC（nmol/min/10⁴ cell） ＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=3.248×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1.010×10^-3 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol /cm；d： 比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.02 mL；V 樣總：加入提取液體積， 1 mL； T： 反應(yīng)時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總  數(shù)，500 萬。