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乙酰輔酶A含量測定試劑盒說明書(分光光度法-10管/9樣)

貨號：LE-1-217

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義

乙酰輔酶 A 廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中。是生物體能源物質(zhì)代謝過程中產(chǎn)生的一種重要的中間代謝產(chǎn)物。在體內(nèi)能源物質(zhì)代謝中是一個樞紐性的物質(zhì)。糖、脂肪、蛋白質(zhì)三大營養(yǎng)物質(zhì)通過乙酰輔酶 A  匯聚成一條共同的代謝通路-三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化，經(jīng)過這條通路徹底氧化生成二氧化碳和水，釋放能量用于 ATP 合成。此外，乙酰輔酶  A 是合成脂肪酸，酮體，膽固醇及其衍生物等生理活性物質(zhì)的前體物質(zhì)。

測定原理

蘋果酸脫氫酶可催化蘋果酸和 NAD 生成草酰乙酸和 NADH。檸檬酸合酶可催化乙酰輔酶 A 和草酰乙酸生成檸檬酸和輔酶 A。利用蘋果酸脫氫酶和檸檬酸合酶的偶聯(lián)反應(yīng)，乙酰輔酶 A 含量和 NADH 的生成速率成正比，340nm 下吸光值的上升速率反應(yīng)了乙酰輔酶 A 含量的高低。

需自備的儀器和用品

紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、 1 mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸 餾水。

試劑的組成和配制

試劑一： 液體 10mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1支， -20℃保存。臨用前加入 100μL 試劑五充分溶解備用；用不完的試劑分 裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑三：液體 4μL×1支， 4℃保存。臨用前加入 100μL 試劑五充分溶解備用；用不完的試劑 分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑四：粉劑×1瓶， -20℃保存。臨用前加入 9mL 試劑五充分溶解備用；用不完的試劑分裝 后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑五： 液體 10mL×1 瓶，4℃保存。

工作液的配制：臨用前請根據(jù)擬用工作液體積（樣本數(shù)×0.92 m L），將試劑二、三和四按 照 1:1:90 的比例混合，或者直接把試劑二和試劑三加入到試劑四中混勻（可以測定 9 樣）； 加樣前置37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴鍋中預(yù)熱 30 min； 現(xiàn)配現(xiàn)用；

乙酰輔酶 A 的提取

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個）：試劑一體積（mL）為 500~1000： 1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 試  劑一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織： 按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）， 進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟

1、分光光度計預(yù)熱 30min，用蒸餾水于 340nm 處調(diào)零。

2、取 920μL 工作液和 100μL 樣本至  1mL 石英比色皿，混勻，立即記錄 340nm 處 20s 的吸 光值 A1 和 80s 時的吸光值 A2，計算 ΔA=A2-A1。

乙酰輔酶 A 含量計算

標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為 y = 1640x + 0.012；x 為吸光值，y 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL）。 

注意：本試劑盒最低檢測限為 1.6nmol/mL。

1、按照蛋白濃度計算

乙酰輔酶 A 含量(nmol/mg prot)=[(1640×ΔA＋0.012) ×V1]÷(V1×Cpr)

=(1640×ΔA＋0.012) ÷Cpr

需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

2、按照樣本質(zhì)量計算

乙酰輔酶 A 含量(nmol/g 鮮重)=[(1640×ΔA＋0.012)  ×V1]÷(W×V1÷V2)

=(1640×ΔA＋0.012) ÷W

3、按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

乙酰輔酶 A 含量(nmol/10⁴)=[(1640×ΔA＋0.012)×V1]÷(500×V1÷V2)

=(1640×ΔA＋0.012)÷500

V1 ：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.1mL；V2：加入提取液體積， 1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃 度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬。