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線粒體檸檬酸（MCA）含量試劑盒說明書（分光光度法-25管/24樣）

貨號：LE-1-218

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

CA 是線粒體三羧酸循環(huán)的第一個中間產(chǎn)物，由檸檬酸合酶催化乙酰 CoA 與草酰乙酸合成，其含量是三羧酸循環(huán)強度的主要指標(biāo)之一。

配合測定丙酮酸含量、丙酮酸脫氫酶活性、乙酰 CoA 含量、檸檬酸合酶活性和 CA 含量，其中（1）丙酮酸含量和丙酮酸脫氫酶活性變化可以反映糖酵解進行程度，（2）綜合分析丙酮酸含量、丙酮酸脫氫酶活性和乙酰 CoA 含量變化可以反映脂肪酸β-氧化途徑提供的乙酰 CoA 情況,（3）乙酰 CoA 含量、檸檬酸合酶活性和CA 含量變化可以反映三羧酸循環(huán)進行狀況。

測定原理：

CA 在檸檬酸裂解酶的作用下，生成α-酮酸（草酰乙酸）；在弱酸性條件下，α-酮酸進一步與苯肼反應(yīng)，生成相應(yīng)的 α-酮酸苯腙； α-酮酸苯腙在 330nm 處有吸收峰，該波長下吸光度的變化程度可反映出 CA 的含量。 

自備儀器和用品：

分光光度計、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、 1mL 石英比色皿、研缽和蒸餾水。

試劑組成和配制：

酸性提取液：液體 25mL×1 瓶，4℃保存。

堿性提取液： 液體 25mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 7.5mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 2.5mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶， 4℃保存； 臨用前加入 7.5mL 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑 4℃保存；

標(biāo)準(zhǔn)品：液體 1mL×1 支， 10μmol/mL 檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)液，4℃保存。

線粒體中檸檬酸提取：

稱 0.05~0.1g 樣品（建議稱 0.1g 樣本），加入 0.5mL 酸性提取液，冰上充分研磨，600g/min 4℃ 離心 5min；取上清至另一 EP 管中，11000g/min 4℃離心 10min，棄上清（取 300μL 該上清 液和 300 μL 堿性提取液中和后可用于細(xì)胞質(zhì) CA 含量測定）； 沉淀即線粒體， 向沉淀中加 入 0.5mL 酸性提取液，充分懸浮溶解，超聲波破碎（功率 20％， 超聲 3 秒， 間隔 10 秒，重 復(fù) 30 次），取此溶液 300μL 和 300μL 堿性提取液中和，混勻， 置冰上待測（不可用于蛋 白質(zhì)含量測定）。

測定步驟：

1、分光光度計預(yù)熱 30 min 以上，調(diào)節(jié)波長到 330nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑一、二和三 37℃預(yù)熱 10min。

3、樣本測定：

空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要各做一個。

充分混勻，330nm 立即測定初始吸光值 A1 和 37℃孵育 30min 后的吸光值 A2，ΔA=A2 –A1。

檸檬酸含量計算：

1、按蛋白濃度計算

檸檬酸含量(μmol/mg  prot)=[C 標(biāo)準(zhǔn)管×(ΔA 測定管-ΔA 空白管)÷(ΔA 標(biāo)準(zhǔn)管-ΔA 空白管) ×V 樣]÷（V 樣÷Cpr）

=10×(ΔA 測定管-ΔA 空白管)÷(ΔA 標(biāo)準(zhǔn)管-ΔA 空白管)÷Cpr

蛋白質(zhì)含量需要另外測定。

2、按樣本鮮重計算

檸檬酸含量(μ mol/g 鮮重)=[C 標(biāo)準(zhǔn)管×(ΔA 測定管-ΔA 空白管)÷(ΔA 標(biāo)準(zhǔn)管-ΔA 空白管) ×V 樣]÷（W×V 樣÷V 樣總）

= 10×(ΔA 測定管-ΔA 空白管)÷(ΔA 標(biāo)準(zhǔn)管-ΔA 空白管)÷W

C 標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)液濃度， 10μmol/mL；  V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積：0.3mL；V 樣總： 加入提取液體積： 1mL；Cpr：樣品蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。

注意：最低檢測限為 10nmol/mg prot 或 1μmol/g 鮮重。