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線粒體復(fù)合體Ⅲ試劑盒說明書(分光光度法)

貨號(hào)：LE-1-301

正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義

線粒體復(fù)合體Ⅲ（EC1.10.2.2） 又稱 CoQ-細(xì)胞色素C還原酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，是線粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分，負(fù)責(zé)把還原型 CoQ 的氫傳遞給細(xì)胞色素C，生成還原型細(xì)胞色素C。

測(cè)定原理

與氧化型細(xì)胞色素C不同，還原型細(xì)胞色素C在550nm有特征光吸收，因此550nm光吸收增加速率能夠反映線粒體復(fù)合體Ⅲ酶活性。

需自備的儀器和用品

可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

試劑一：25mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑二：5mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑三：0.5 mL×1 支，-20℃保存；

試劑四：液體 20mL×1 瓶，4℃保存；

試劑五：粉劑×1 支，-20℃保存；

試劑六：液體 2.5mL×1 瓶，-20℃保存；

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬細(xì)菌或細(xì)胞，加入1mL試劑一和10uL試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、將勻漿600g，4℃離心 5min。

3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

4、上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅲ（此步可選做）。

5、步驟④中的沉淀即為線粒體，加入200uL試劑二和2uL試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10秒，重復(fù)30次），用于復(fù)合體Ⅲ酶活性測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 550nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定

（1） 工作液的配制：臨用前把試劑五轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解，置于 37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）孵育 5min；用不完的試劑 4℃可保存一周；

（2） 在 1mL 玻璃比色皿中加入 40μL 樣本、100μL 試劑六和 800μL 工作液，立即混勻，記錄 550nm 處初始吸光值 A1 和 2min 后的吸光值 A2，計(jì)算 ΔA=A2-A1。

復(fù)合體Ⅲ活力單位的計(jì)算：

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。

復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V 樣) ÷T

=615×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

2、按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 還原型細(xì)胞色素 C 定義為一個(gè)酶活力單位。

復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總)÷T

=124×ΔA÷W

3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。

復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min/10⁴cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T

=0.248×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，9.4×10^-4 L；ε：細(xì)胞色素 C 摩爾消光系數(shù)，1.91×10⁴L/mol/cm；

d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.04 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL；

T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬。