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貨號(hào)：LE-1-304

正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義

TH 位于線粒體的內(nèi)膜上，又稱為呼吸電子傳遞鏈復(fù)合體六， 催化 NADH+NADP⁺ 和 NAD⁺ +NADPH 相互轉(zhuǎn)化。催化正向反應(yīng)稱為 TH-1。線粒體 NADH 含量增加時(shí)會(huì)導(dǎo)致線粒 體膜的 H+電化學(xué)梯度升高，因而促進(jìn)了電子傳遞鏈上 ROS 的產(chǎn)生。TH-1 促進(jìn) NADH 轉(zhuǎn)換 為 NADPH ，從而提高線粒體的抗氧化能力。

測定原理

NADH 和 NADPH 均在 340nm 有特征吸收，因此 TH 催化的轉(zhuǎn)氫反應(yīng)不能導(dǎo)致 340nm 吸光度發(fā)生變化。用人工合成底物 3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸（APADP⁺）替代 NADP⁺ ，TH-1 催化 APADP⁺ 還原生成的 APADPH 在 375nm 有特征光吸收，因此通過測定375nm 光吸收增加速率，來計(jì)算 TH-1 活性。

需自備的儀器和用品

可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、 1mL  玻璃比色皿、研缽、冰和蒸 餾水。

試劑的組成和配制

試劑一： 液體 50mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑二： 液體 25mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑三： 液體 25mL×2 瓶，4℃保存；

試劑四：粉劑×2 支，-20℃保存；

試劑五：粉劑×2 支，-20℃保存；

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

①   準(zhǔn)確稱取 0.1g 組織或收集 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞，加入 1mL 試劑一 ，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

②   將勻漿 600g，4℃離心 5min。

③   棄沉淀，將上清液移至另一離心管中， 11000g，4℃離心 10min。

④   上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線粒體泄漏的 TH-1（此步可選做）。

⑤    步驟 ④ 中的沉淀即為線粒體，加入 500uL 試劑二，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W， 超聲 3s，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次），用于 TH-1 活性測定。

測定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 375nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

（1） 工作液的配制： 臨用前取試劑三、試劑四和試劑五各一支，將試劑四、五轉(zhuǎn)移到試劑 三中混合溶解 ，置于 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 5min；用不完的試劑分裝 后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

（2） 在 1mL 玻璃比色皿中加入 100μL 樣本和 1000μL 工作液，混勻，立即記錄 375nm 處初始吸光值 A1 和  10min 后的吸光值 A2 ，計(jì)算 ΔA=A2-A1。

TH-1 活性計(jì)算

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1 nmolAPADPH 定義為一個(gè)酶活性單位。

TH-1 活性（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反總÷  (ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V 樣)÷T

=164×ΔA÷Cpr

2、按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每 g 組織每分鐘產(chǎn)生 1 nmolAPADPH 定義為一個(gè)酶活性單位。

TH-1 活性（nmol/min/g  鮮重）=[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(V 樣÷V 樣總×W) ÷T

=82×ΔA÷W

3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1 nmolAPADPH 定義為一個(gè)酶活性單位。

TH-1 活性（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(V 樣÷V 樣總×500) ÷T

=0.164×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1.1×10^-3 L；ε：APADPH 摩爾消光系數(shù)，6.7×10³ L / mol /cm；d： 比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.1 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.5mL； T： 反應(yīng)時(shí)間， 10  min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度， mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細(xì)菌或細(xì)胞  總數(shù)，500 萬。