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抗壞血酸含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)（分光光度法）

貨號(hào)：LE-1-273

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

提取液： 液體100mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一： 液體15mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二： 液體8mL×1 瓶，4℃保存；

試劑三： 液體15mL×1 瓶，4℃保存；

標(biāo)準(zhǔn)品： 粉劑10mg×1 瓶（避光） ，4℃保存（稱(chēng)取1mg加入10mL提取液，即為100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品）

試驗(yàn)中所需的儀器和試劑：

研缽、冰、低溫離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)、1 μL玻璃比色皿、可調(diào)式移液器和蒸餾水。

產(chǎn)品說(shuō)明：

AsA 又稱(chēng)維生素c 。AsA 是輔酶、自由基清除劑、電子共體/受體和草酸鹽與酒石酸鹽生物合成的底 物等。作為植物細(xì)胞中最重要的抗氧化劑，AsA 在保護(hù)葉綠體免于氧化損傷起著舉足輕重的作用，也  是衡量農(nóng)作物產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。

抗壞血酸具有較強(qiáng)還原能力將Fe3+還原成Fe2+，鄰二氮菲與Fe2+會(huì)形成紅色螯合物，在534nm處具 有強(qiáng)的吸收法，且吸光值與反應(yīng)液中抗壞血酸含量呈正比。

操作步驟：

一、樣品的前處理：

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~ 10 的比例（建議稱(chēng)取約 0. 1g 組織，加 入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g ，4℃離心 20min ，取上清置冰上待測(cè)。

2、細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（ 10⁴個(gè)） ：提取液體積（ μL）為500~ 1000：1 的比例（建議500 萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液） ，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w ，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間  3min）；8000g ，4℃離心 20min ，取上清液置冰上混勻待測(cè)。

3、血清等液體：按照樣本體積（g）：提取液體積(mL)為 1：5~ 10 的比例（建議稱(chēng)取約 0. 1mL 樣本，加入1mL提取液） 進(jìn)行混勻。8000g ，4℃離心 20min ，取上清置冰上待測(cè)。

二、測(cè)定操作表：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 534nm ，提取液調(diào)零。

2、測(cè)定前將所有試劑 37℃（哺乳動(dòng)物） 或25℃ （其它物種） 水浴5min 以上。

3、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制及樣本測(cè)定（按順序加入下列試劑）

充分混勻，室溫靜置 15min 后，534nm 處測(cè)定各管吸光值。如底部有沉淀，離心后再讀數(shù)

三、抗壞血酸含量計(jì)算

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，將樣品△A 帶入公式中（x ），計(jì)算出樣品濃度 y（μg/mL）。 

1、按蛋白濃度計(jì)算

抗壞血酸（μg / mg prot）=y×V  樣÷ （V  樣×Cpr）

2、按樣本鮮重計(jì)算

抗壞血酸（μg /g 鮮重） = y×V  樣÷(V  樣÷V  樣總×W)

3、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

抗壞血酸（μg /10⁶ceLL）= y×V  樣÷(V  樣÷V  樣總×細(xì)胞數(shù)量)

4、按體積計(jì)算

抗壞血酸（μg /mL）=10y

V 樣總：上清液總體積，mL；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積；W：樣品質(zhì)量，g ；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；細(xì)胞數(shù)量：以 106 為單位計(jì)量；T：樣本稀釋倍數(shù)。

注意事項(xiàng)：

1、樣品處理需勻漿完全，抗壞血酸易分解，需避光保存

2、標(biāo)準(zhǔn)品：現(xiàn)配現(xiàn)用。

3、若不確定樣品中抗壞血酸 含量的高低，可稀釋幾個(gè)梯度后再進(jìn)行測(cè)量。

4、因?yàn)樘崛∫褐泻械鞍踪|(zhì)沉淀劑，因此上清液不能用于蛋白濃度測(cè)定。