伊人久久大香线焦|久久青青草国产第一页|亚洲国产九九九热视频|超乳视频爆乳无码免费专区|欧美日韩亚洲视频一区二区|少妇高潮惨叫喷水在线观看|亚洲区欧美区偷拍区中文字幕|国产日韩一区二区三区在线观看

貨號(hào)：LE-2-270

正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

TrxR是一種NADPH依賴的包含F(xiàn)AD結(jié)構(gòu)域的二聚體硒酶，屬于吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶家族成員，與硫氧還蛋白以及 NADPH 共同構(gòu)成了硫氧還蛋白系統(tǒng)。TrxR與GR活性類似，催化GSSG還原生成GSH，是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)關(guān)鍵酶之一。

測(cè)定原理：

TrxR催化NADPH還原DTNB生成TNB和NADP⁺，TNB在412nm有特征吸收峰，通過測(cè)定412nm波長(zhǎng)處TNB的增加速率，即可計(jì)算TrxR活性。

自備儀器和用品：

低溫離心機(jī)、可調(diào)節(jié)移液器、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1 瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃避光保存。臨用前加入 2mL 蒸餾水溶解。

試劑三：粉劑×1 管，4℃保存。臨用前加入 2mL 蒸餾水溶解。

粗酶液提?。?/span>

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g 組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。

2、細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3、血清等液體：直接測(cè)定。

TrxR 測(cè)定操作：

1、分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到412nm，用蒸餾水調(diào)零。

2、試劑一在25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動(dòng)物）預(yù)熱30min。

3、空白管：取微量玻璃比色皿或96孔板，加入20μL試劑二，20μL試劑三，160μL試劑一，迅速混勻后于412nm 測(cè)定10s和310s吸光度，記為A1和A2?！鰽空白管=A2-A1。

4、測(cè)定管：取微量玻璃比色皿或96孔板，加入20μL試劑二，20μL試劑三，140μL試劑一，20μL上清液，迅速混勻后于412nm測(cè)定10s和310s吸光度，記為A3和A4?！鰽 測(cè)定管=A4-A3。

注意：空白管只需測(cè)定一次。

TrxR 活性計(jì)算公式：

1、按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個(gè)酶活單位。

TrxR（nmol/min/mg prot）=（△A測(cè)定管-△A空白管）÷ε÷d×V反總÷(Cpr×V樣)÷T

= 147×（△A 測(cè)定管-△A 空白管）÷Cpr

2、按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每克樣本每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個(gè)酶活單位。

TrxR（nmol/min/g）=（△A測(cè)定管-△A空白管）÷ε÷d×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

= 147×（△A 測(cè)定管-△A 空白管）÷W

3、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個(gè)酶活單位。

TrxR（nmol/min/10⁴cell）=（△A測(cè)定管-△A空白管）÷ε÷d×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

= 147×（△A 測(cè)定管-△A 空白管）÷ 細(xì)胞數(shù)量

4、按液體體積計(jì)算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫升液體每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個(gè)酶活單位。

TrxR（nmol/min /mL）=（△A 測(cè)定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反總÷V 樣÷T

= 147×（△A 測(cè)定管-△A 空白管）

ε：TNB 在412nm處的微摩爾消光系數(shù)，0.0136 L/μmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積（L），200μL=2×10 ^-4 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定；W ：樣品質(zhì)量；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），20μL=0.02 mL；V 樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min），5 min。

b.  使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個(gè)酶活單位。

TrxR（nmol/min/mg prot）=（△A測(cè)定管-△A空白管）÷ε÷d×V 反總÷(Cpr×V 樣)÷T

= 294×（△A 測(cè)定管-△A 空白管）÷Cpr

2、按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每克樣本每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個(gè)酶活單位。

TrxR（nmol/min/g）=（△A測(cè)定管-△A空白管）÷ε÷d×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

= 294×（△A 測(cè)定管-△A 空白管）÷W

3、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個(gè)酶活單位。

TrxR（nmol/min/10⁴cell）=（△A測(cè)定管-△A空白管）÷ε÷d×V 反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V 樣總)÷T

= 294×（△A 測(cè)定管-△A 空白管）÷ 細(xì)胞數(shù)量

4、按液體體積計(jì)算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫升液體每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個(gè)酶活單位。

TrxR（nmol/min/mL）=（△A測(cè)定管-△A空白管）÷ε÷d×V 反總÷V 樣÷T

= 294×（△A 測(cè)定管-△A 空白管）

ε：TNB 在412nm處的微摩爾消光系數(shù)，0.0136 L/μ mol/cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積（L），200μL=2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定；W ：樣品質(zhì)量；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），20μL=0.02 mL；V 樣總：

提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min），5 min。

注意事項(xiàng)：

1、測(cè)定前須先取 1～2 個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，使得吸光值在 5min 內(nèi)程線性變化。哺乳動(dòng)物組織及

血液制品 TrxR 活力測(cè)定時(shí)，一般須用蒸餾水稀釋 5 倍左右；測(cè)定過程操作須迅速。

2、試劑二和試劑三配制好后 3 天內(nèi)使用完。